Schwanzflosse des Zebrafisches als Modell zur Untersuchung der Rolle von Probiotika bei der Knochenregeneration

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 8057 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Probiotika sind lebende Mikroorganismen, die dem Wirt verschiedene positive Wirkungen verleihen, darunter die Verbesserung der Knochenmineralisierung. Die probiotische Wirkung auf die Knochenregeneration ist jedoch nicht gut untersucht und daher haben wir verschiedene Auswirkungen der probiotischen Behandlung auf die Schwanzflossenregeneration von Zebrafischen analysiert. Die morphologische Analyse ergab eine vergrößerte regenerierte Fläche mit kürzeren und dickeren Lepidotrichiensegmenten nach der probiotischen Behandlung. Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-Bildgebungsanalyse verdeutlichte die Verteilung der Phosphatgruppen in den regenerierten Flossen und die probiotische Gruppe zeigte höhere Mengen an gut kristallisiertem Hydroxylapatit. In der Mitte (5 Tage nach der Amputation) der Regeneration waren Probiotika in der Lage, verschiedene Stadien der Osteoblastendifferenzierung zu modulieren, was durch die Hochregulierung einiger wichtiger Markergene wie runx2b, sp7, col10a1a, spp1 und bglap bestätigt wurde, und unterdrückten außerdem nachweislich die Osteoklastenaktivität aus der Herunterregulierung von ctsk. Probiotika verursachten auch einen verbesserten Zellzyklus, indem sie die Expression von Genen regulierten, die an den Signalwegen Retinsäure (rarga, cyp26b1) und Wnt/β-Catenin (ctnnb1, ccnd1, axin2, sost) beteiligt sind, und modulierten auch die Phosphathomöostase durch Erhöhung der entpd5a-Spiegel . Diese Erkenntnisse bieten neue Perspektiven für den Einsatz von Probiotika als prophylaktische Behandlung zur Beschleunigung der Knochenregeneration und Verbesserung der Skelettgesundheit sowohl in der Aquakultur als auch im biomedizinischen Bereich.

Probiotika sind nützliche Mikroben, die zahlreiche gesundheitliche Vorteile für den Wirt haben können, einschließlich Auswirkungen auf den Knochenstoffwechsel, wie in verschiedenen Tiermodellen wie Geflügel und Nagetieren berichtet1,2,3. Darüber hinaus haben im Zebrafischmodell nur wenige Studien eindeutige Beweise für die Rolle von Probiotika bei der Beschleunigung der Skelettbildung und Mineralisierung geliefert4,5. Die Verabreichung von Probiotika moduliert im Wesentlichen das Wirtsmikrobiom6, das nachweislich den Knochenstoffwechsel auf viele mögliche Arten beeinflusst, einschließlich der Metabolitenproduktion7, hormoneller Interaktionswege, osteoimmunologischer Reaktionen8 oder über die Synthese von Vitaminen9. Viele probiotische Arten wie Bacillus subtilis sind dafür bekannt, Vitamine mit osteogenen Eigenschaften wie Vitamin K210 zu produzieren.

Die Schwanzflosse des Zebrafisches hat sich als äußerst erfolgreiches Modellsystem für die Untersuchung der grundlegenden Mechanismen der Geweberegeneration erwiesen. Unter Laborbedingungen bietet es mehrere Studienvorteile wie die einfache Live-Verfolgung, die Zugänglichkeit der Flossen und das Fehlen größerer Amputationen, die schädliche Auswirkungen auf die Fische haben11. Der Zebrafisch bietet als genetisches Modell für die Knochenregeneration den zusätzlichen Wert, die Erkenntnisse in biomedizinische Perspektiven in regenerative Arzneimittel für den Menschen zu übertragen12,13. Die Expression von Orthologen für wichtige osteogene molekulare Akteure bei Säugetieren wie β-Catenin wurde zusätzlich zu den Orthologen für ihre nachgeschalteten Ziele in der regenerierenden Flosse nachgewiesen14,15,16. Zebrafische regenerieren amputierte Schwanzflossen, indem sie abstammungsbeschränkte Blastemzellen erzeugen17,18. Nach einer teilweisen Amputation regeneriert sich die Flosse mit knöchernen Strahlen und weichem Zwischenstrahlgewebe sehr stark durch die Bildung von Blastemen, bei denen es sich um Populationen von mesenchymalen Vorläuferzellen mit eingeschränkter Abstammung handelt, die durch Dedifferenzierung reifer Stumpfzellen gebildet werden19,20. Der Pool dedifferenzierter Osteoblasten im Blastem proliferiert, differenziert sich ausschließlich in nicht proliferierende Osteoblasten neu und lagert im Verlauf der Regeneration Knochenmatrix ab19. Diese Differenzierungsschritte werden durch verschiedene Osteoblasten-Stadiumsmarker unterschieden, wie etwa den Transkriptionsfaktor 2b der RUNX-Familie (runx2b) für Osteoblasten-Vorläufer in Richtung des distalen Teils des proximalen Blastems, gefolgt von sp7-Transkriptionsfaktor (sp7 oder Osterix) positiven Osteoblasten und schließlich Knochen-Gamma-Carboxyglutamat ( gla) Protein (bglap oder Osteocalcin) positive reife Osteoblasten bis zum proximalen Ende21. Es wurde festgestellt, dass die erneute Expression von sp7 und die Abnahme von bglap Indikatoren für die Dedifferenzierung von Zellen im Blastem während der Regeneration sind22. Mehrere andere Signalwege, darunter RA (Retinsäure)23 und Wnt/β-Catenin24,25, wurden als wesentlich für die Flossenregeneration identifiziert.

Basierend auf den Erkenntnissen aus der Literatur bestand das Ziel der vorliegenden Studie darin, die möglichen Auswirkungen der Verabreichung von Probiotika auf den Regenerationsprozess der Schwanzflossen zu untersuchen. Fische wurden vor der Amputation zwei Wochen lang mit Probiotika vorbehandelt, um die Kolonisierung nützlicher Bakterien im Darm der behandelten Fische zu fördern und die gewünschten positiven Ergebnisse zu erzielen, wie zuvor bei anderen Probiotikaarten bestätigt26. Mithilfe eines multidisziplinären Ansatzes, der von der Analyse morphologischer Parameter im Zusammenhang mit dem Flossenwachstum über die Bewertung der Expression repräsentativer Gene, die an der Ossifikation beteiligt sind, bis hin zur Quantifizierung von Phosphaten und anderen Makromolekülen reicht, wollten wir Beweise für die Rolle probiotischer Bakterien bei der Knochenregeneration gewinnen könnte bei der Entwicklung regenerativer Medizinprotokolle helfen und Aquakulturpraktiken verbessern. In dieser Hinsicht wird in der aktuellen Studie die mögliche probiotische Wirkung auf Knochen durch entweder erhöhte Osteoblastenaktivität oder verringerte Osteoklastenaktivität unter Verwendung spezifischer Markergene von Osteoblasten und Osteoklasten untersucht, wie z. B. sezerniertes Protein, saures, cysteinreiches (Sparc oder Osteonectin). bzw. Cathepsin K (ctsk)27.

Um eine vorläufige Bestätigung darüber zu erhalten, ob die probiotische Behandlung den Regenerationsprozess beeinflussen kann, wurden einige morphometrische Parameter der sich regenerierenden Flossen analysiert. Die Regenerationsleistung zwischen Kontroll- (C) und mit Probiotika behandelten (P) Versuchsgruppen wurde 5 Tage nach der Amputation (DPA) und 10 DPA durch Analyse der Flossenstrahlbreite (RAY) bewertet, die durch Mittelung der Breite der zweiten Gabelflosse berechnet wurde Strahl im Rückenlappen am ersten gebildeten Segmentgelenk nach der Amputation; Segmentlänge (SEG), berechnet durch Mittelung der Länge des ersten gebildeten Segments nach der Amputation im zweiten gegabelten Flossenstrahl im Rückenlappen; REG/STU, das Verhältnis zwischen regenerierter Fläche (REG) und Stumpfbreite (STU), und schließlich REG/PED, das Verhältnis zwischen REG und Stielbreite (PED). Der vollständige Regenerationsverlauf wurde für C- (n = 7) und P-Fische (n = 7) jeden Tag zur gleichen Zeit verfolgt. In Abb. 1a sind Bilder repräsentativer C- und P-Flossen desselben verfolgten Fisches für die Zeit vor der Amputation, nach der Amputation und 1, 5 und 10 DPA dargestellt. Dargestellt ist ein repräsentatives Bild einer regenerierenden Flosse mit REG-, STU-, RAY-, SEG- und PED-Messungen (Abb. 1b). Eine spezifische Gleichung wurde gegenüber einer früheren Studie geändert, um die prozentuale Regeneration unter Verwendung der Verhältnisse REG/STU und anfänglich amputierte Fläche/STU28 zu berechnen. Die modifizierte Gl. (1) wird im Folgenden dargestellt:

(a) Repräsentative Fotos, die die Flossen vor der Amputation, nach der Amputation und bei 1, 5 und 10 DPA in Kontrollgruppen (C) (n = 7) und mit Probiotika behandelten Gruppen (P) (n = 7) zeigen (Maßstabsbalken = 2.000 µm). ); (b) Bild einer repräsentativen amputierten Flosse mit Darstellung des regenerierten Bereichs (REG, grün gepunktete Linie), der Stumpfbreite oder Breite der Amputationsebene (STU, rote gepunktete Linie), der Flossenstrahlbreite (RAY, rosa Linie), die Segmentlänge (SEG, gelbe Linie) und die Stielbreite (PED, blaue gepunktete Linie); (c) Statistische Analyse der Regenerationsrate (ausgedrückt in %) zwischen C- und P-Gruppen, berechnet bei 10 DPA in Bezug auf die Flosse vor der Amputation desselben Fisches. (d–g) Verschiedene morphometrische Parameter zur Analyse der regenerierten Bereiche in C- und P-Flossen (n = 7 pro Gruppe und Zeitpunkt). (d) Verhältnis regenerierter Bereich (REG)/Pedunkelbreite (PED); (e) Verhältnis regenerierte Fläche (REG)/Stumpfbreite (STU); (f) Mittlere Strahlbreite (RAY) und (g) Mittlere Segmentlänge (SEG). Der T-Test wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu analysieren. Die %-Werte wurden vor der Anwendung des T-Tests in entsprechende Dezimalwerte umgewandelt und die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Dieser Parameter war bei P-Flossen um 8–9 % höher als in der C-Gruppe bei 10 DPA (Abb. 1c).

Das REG/STU-Verhältnis war sowohl bei 5 DPA (p = 0,036) als auch bei 10 DPA (p = 0,036) bei P-Flossen signifikant höher als bei C-Flossen, wohingegen beim REG/PED-Verhältnis kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen beobachtet wurde, obwohl es das gleiche aufwies Muster wie das von REG/STU (Abb. 1d, e). Die Stumpfbreite (STU) wurde verwendet, um die Variabilität zwischen den Proben zu normalisieren, die sich aus der variablen Größe und Ausrichtung der Flosse ergibt. Daher gilt REG/STU als der beste Standard zur Normalisierung der regenerierten Fläche29. Daher könnte das Fehlen eines signifikanten Unterschieds für das Verhältnis REG/PED zwischen P und C auf einen nicht signifikanten Anstieg des PED zurückzuführen sein, der mit einer möglichen Variabilität der Körpergröße zwischen den Proben verbunden ist. Eine weitere interessante Beobachtung war, dass die P-Gruppe im Vergleich zu C bei 10 DPA dickere Flossenstrahlen (mittlerer Strahl; Abb. 1f) und kürzere Segmente (mittlerer SEG; Abb. 1g) aufwies. Während des Versuchs wurden keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht und in der Gesamtlänge zwischen C- und P-Fischen beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die P-Behandlung den Regenerationsprozess beschleunigte und die größeren regenerierten P-Flossen kürzere, aber dickere Segmente aufwiesen.

FTIRI ist ein geeignetes Instrument zur Untersuchung der Knochenzusammensetzung, insbesondere des mineralischen und organischen Matrixgehalts, indem relative Konzentrationen anhand der Spitzenintensitätsverhältnisse verschiedener chemischer Komponenten berechnet werden30. In Abb. 2a ist ein repräsentatives Bild der Flosse dargestellt, das die beiden Bereiche der FTIRI-Analyse, proximal und distal, auf dem vierten gegabelten Flossenstrahl im Rückenflossenlappen zeigt. In Abb. 2b, c ist die hyperspektrale Bildanalyse von C- und P-amputierten Flossen zu zwei Zeitpunkten der Regeneration, 5 und 10 DPA, dargestellt. Wie erwartet wurde innerhalb der kartierten Gebiete eine inhomogene Verteilung beobachtet und die Verteilung der Phosphate stimmte eindeutig mit den Knochenstrukturen in beiden analysierten Regionen überein. In der Actinotrichia (siehe schwarz gepunktetes Quadrat in den distalen Karten; Abb. 2b, c) wurde ein niedrigerer Phosphatgehalt festgestellt, was auf eine geringere Mineralisierung dieser Zone hinweist.

(a) Repräsentatives Bild, das die von FTIRI analysierten Bereiche im vierten gegabelten Flossenstrahl des Rückenlappens der regenerierenden Flosse zeigt. Die beiden nach der Amputation untersuchten Regionen waren: proximal – entsprechend der ersten gebildeten Bifurkation nach der Amputation und distal – entsprechend dem letzten Segmentgelenk vor der Aktinotrichie; (b und c) Repräsentative Mikrofotografie (links) und Falschfarbenbilder (rechts), die die topografische Verteilung der Phosphatgruppen in den proximalen und distalen Bereichen der regenerierten Flosse aus C- und P-Flossen (n = 3) bei (b) 5 DPA zeigen und (c) 10 DPA-Zeitpunkte. Für alle Falschfarbenbilder wurde die gleiche Farbskala (0–3) verwendet: Weiß/Hellrosa kennzeichnen die Bereiche mit der höchsten Phosphatmenge, Rot/Orange/Gelb die Bereiche mit einem mittleren Phosphatgehalt und Schwarz/Dunkelblau die Gebiete mit der geringsten Menge an Phosphaten. Die schwarz gepunkteten Quadrate zeigen den Bereich an, in dem Spektren für die Kurvenanpassungsanalyse extrahiert wurden; (d–f) Biochemische Zusammensetzung und Knochenmineralisierung, bewertet durch FTIRI-Analyse. Histogramme, die die Bandflächenverhältnisse (d) A1655/A1024, (e) A1240/A1024 und (f) A1024/A1090 darstellen, werden auf proximalen und distalen Regionen der regenerierenden Flosse aus C (n = 3) und P (n = 3) berechnet. Flossen bei 5 DPA und 10 DPA. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verschiedene Buchstaben über den Histogrammen weisen auf einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen hin. Es werden eine Zwei-Wege-ANOVA und der Tukey-Mehrfachvergleichstest verwendet, und die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Um die biochemische Zusammensetzung und den Mineralisierungsgrad des Knochens in den beiden analysierten Regionen zu bewerten, wurden die folgenden Bandenflächenverhältnisse berechnet: A1655/A1024 (Verhältnis zwischen der Fläche der Amid-I-Bande der Proteine mit der Mitte bei 1655 cm−1 und der Fläche von die Phosphatbande liegt zentriert bei 1024 cm−1; Abb. 2d); A1240/A1024 (Verhältnis zwischen der Fläche des Kollagenbandes mit der Mitte bei 1240 cm−1 und der Fläche der Phosphatbande mit der Mitte bei 1024 cm−1; Abb. 2e) und A1024/A1090 (Verhältnis zwischen der Fläche der Phosphatbande mit der Mitte bei 1024 cm−1 und 1090 cm−1, zurückzuführen auf gut bzw. schlecht kristallisierte Hydroxylapatite (HA); Abb. 2f). Die Verhältnisse A1655/A1024 und A1240/A1024 beziehen sich normalerweise auf die relative Menge der organischen Komponente (Proteine und Kollagene) im Verhältnis zur anorganischen/mineralischen Komponente (Knochen-HA)31. Diese beiden Verhältnisse zeigten eine Abnahme im proximalen Bereich im Vergleich zum distalen Bereich. Darüber hinaus wurden bei 5 DPA im distalen Bereich statistisch signifikant niedrigere Werte für diese Verhältnisse in der P-Gruppe im Vergleich zu C gefunden (p < 0,05), was auf eine höhere Menge der Mineralkomponente in den P-Flossen hinweist. Umgekehrt wurde für diese beiden Verhältnisse bei 10 DPA kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen C- und P-Gruppen in beiden analysierten Regionen beobachtet (p > 0,05) (Abb. 2d, e). Das A1024/A1090-Verhältnis bezieht sich auf die Mineralreife des Knochens und stellt die Umwandlung von HA von einer nanokristallinen Form (dargestellt durch den Peak bei 1090 cm−1) in eine gut kristallisierte stöchiometrische Form (dargestellt durch den Peak bei 1024 cm−) dar 1)32. Im distalen Bereich wurden in P-Proben sowohl bei 5 DPA als auch bei 10 DPA statistisch signifikant höhere Werte im Vergleich zu C gefunden. Im proximalen Bereich blieb das Verhältnis zwischen C- und P-Proben gleich (p > 0,05) (Abb. 2f). . Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf einen Anstieg des Mineralgehalts und der Mineralreife in den regenerierten Flossen aufgrund der P-Behandlung hin.

Die Flossenregeneration ist ein Prozess, an dem Zellen vom Präosteoblasten bis zum reifen Osteoblasten beteiligt sind. Daher ist es wichtig zu berücksichtigen, dass eine probiotische Behandlung in verschiedenen Osteoblastenstadien unterschiedlich wirken kann. In unserer Studie stiegen die mRNA-Spiegel früher und mittlerer Marker der Osteoblastendifferenzierung wie runx2b, sp7 und Kollagen 10a1a (col10a1a) während der Regeneration bei 5 DPA im Vergleich zu 0 DPA sowohl in C als auch P. Sowohl runx2b- als auch col10a1a-mRNA zeigten eine deutlich höhere Expression in der P-Gruppe im Vergleich zu C bei 5 DPA und col10a1a wurde auch in den P-Flossen bei 0 DPA stark exprimiert. Der späte Marker bglap war sowohl bei C als auch bei P signifikant erhöht, als der Regenerationsprozess fast abgeschlossen war (10 DPA), aber ein signifikanter Unterschied zwischen C und P wurde insbesondere bei 5 DPA beobachtet. Die Expression des reifen osteoblastenspezifischen Markers, sekretiertes Phosphoprotein 1 (spp1 oder Osteopontin), war in behandelten Flossen bei 5 DPA signifikant höher (Abb. 3). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die P-Behandlung das Fortschreiten der Osteoblasten von der frühen Differenzierung bis zur Mineralisierung der extrazellulären Matrix beschleunigen kann.

runx2b-, sp7-, col10a1a-, bglap- und spp1-mRNA-Werte normalisiert gegen rplp0 und rpl13 in Flossen, die aus den Gruppen C (n = 3) und P (n = 3) bei 0, 5 und 10 DPA gesammelt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verschiedene Buchstaben über den Histogrammen weisen auf einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen hin. Es werden eine Zwei-Wege-ANOVA und der Tukey-Mehrfachvergleichstest verwendet, und die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Frühere Studien berichteten über die Beteiligung von RA-Signalen an der Proliferation von Blastemzellen, einem Schlüsselprozess bei der Flossenregeneration, der auch durch Wnt/β-Catenin-Signale reguliert wird33. Darüber hinaus erfordert die Skelettogenese im Zebrafisch eine genaue Kontrolle der RA-Spiegel und der Cyp26b1-Aktivität34. Bei 5 DPA war das RA-abbauende Enzym, kodiert durch Cytochrom P450, Familie 26, Unterfamilie b, Polypeptid 1 (cyp26b1) mRNA, in der P-Gruppe signifikant höher und war mit einer verringerten Expression des Retinsäurerezeptors Gamma-a (Rarga) verbunden. in Bezug auf C. Es wurde auch festgestellt, dass die Rarga-mRNA-Expression in den anfänglich amputierten Flossen (0 DPA) der mit P behandelten Gruppe höher war als in C. Eine Erhöhung der Expression von Ectonukleosidtriphosphatdiphosphohydrolase 5a (entpd5a), die an der beteiligt ist Homöostase von Phosphaten wurde auch bei 0 bis 5 DPA sowohl in der C- als auch in der P-Gruppe beobachtet. Bei 10 DPA nahm die Expression des entpd5a-Gens ab und nur zu diesem Zeitpunkt war sein mRNA-Spiegel in der P-Gruppe im Vergleich zur Kontrolle signifikant höher (Abb. 4). Die bei diesen Genen beobachteten Expressionsänderungen weisen darauf hin, dass eine probiotische Behandlung den RA-Signalweg modulieren und auch die Phosphathomöostase während der Regeneration regulieren kann.

rarga-, cyp26b1- und entpd5a-mRNA-Werte normalisiert gegen rplp0 und rpl13 in Flossen, die aus den Gruppen C (n = 3) und P (n = 3) bei 0, 5 und 10 DPA gesammelt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verschiedene Buchstaben über Histogrammen weisen auf einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen hin. Es werden eine Zwei-Wege-ANOVA und der Tukey-Mehrfachvergleichstest verwendet, und die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Die durch Wnt/β-Catenin vermittelte Signalübertragung spielt eine wichtige Rolle bei der Proliferation von Blastemzellen16 und die Analyse der Expression einiger Schlüsselgene, die an diesem Signalweg beteiligt sind, kann wichtige Informationen über die Wirkung einer probiotischen Behandlung auf die Proliferation und frühe Differenzierung von Osteoblasten während der Flossenregeneration liefern. Das Catenin (Cadherin-assoziiertes Protein), Beta 1 (ctnnb1), war in der P-Gruppe sowohl bei 5 DPA als auch bei 10 DPA signifikant höher, wohingegen sein universelles Transkriptionszielgen Axin2, das auch ein negativer Feedback-Regulator in der kanonischen Wnt-Signalisierung ist, signifikant höher war höher in P-Flossen bei 10 DPA. Sparc, das das für das Sparc-Protein kodierende Gen darstellt, von dem bekannt ist, dass es den Abbau von β-Catenin verhindert, war bei 5 DPA in beiden Gruppen ebenfalls signifikant höher als bei 0 DPA, jedoch ohne signifikanten Unterschied zwischen C- und P-Gruppe. Der negative Regulator des Wnt-Signals, Sclerostin (sost), und das Osteoklasten-Markergen ctsk waren in C bei 5 DPA signifikant höher, wohingegen bei 10 DPA der sost in der P-Gruppe höher war als in C. Ein weiteres nachgeschaltetes Transkriptionszielgen von β-Catenin ist Cyclin D1 (ccnd1), das auch ein Marker für die Zellproliferation ist, und seine mRNA wurde auch in P-Flossen in Bezug auf C bei 5 DPA hochreguliert (Abb. 5). Insgesamt liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass die Erhöhung der β-Catenin-Transkriptionsaktivität die Expression mehrerer nachgeschalteter Regulatorgene antreibt, die auch am Flossenregenerationsprozess beteiligt sind. Somit wurde festgestellt, dass der Wnt/β-Catenin-Signalweg durch die P-Behandlung moduliert wird, was zu einem verstärkten Zellzyklus führt, wodurch der Regenerationsprozess beschleunigt wird und zu einer vergrößerten regenerierten Fläche führt, wie aus den morphologischen Ergebnissen hervorgeht.

ctnnb1-, axin2-, sparc-, sost-, ctsk- und ccnd1-mRNA-Werte normalisiert gegen rplp0 und rpl13 in Flossen, die aus den Gruppen C (n = 3) und P (n = 3) bei 0, 5 und 10 DPA gesammelt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verschiedene Buchstaben über Histogrammen weisen auf einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen hin. Es werden eine Zwei-Wege-ANOVA und der Tukey-Mehrfachvergleichstest verwendet, und die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Unter Verwendung des etablierten Zebrafischflossen-Regenerationsmodells haben wir die Modulation der Regeneration in der Schwanzflosse des Zebrafisches durch probiotische Behandlung bewertet. Da bei den behandelten Fischen im Vergleich zur ursprünglich amputierten Fläche eine vergrößerte Fläche regenerierter Flossen, jedoch keine Veränderungen in der Gesamtlänge, dem Gewicht und der Stielbreite auftraten, kann die vergrößerte regenerierte Fläche schlüssig mit der Wirkung der P-Behandlung auf die Regeneration und nicht mit dem Fischwachstum in Verbindung gebracht werden Flossenausrichtung. Darüber hinaus wechselten die C-Flossen nach der Regeneration des amputierten Bereichs wieder zum isometrischen Wachstum, während die P-Flossen das allometrische Wachstumsmuster der Regeneration auch nach Erreichen des ursprünglich amputierten Bereichs beibehielten. Dies führte zu einem deutlich erhöhten Wachstum des Flossenbereichs mit kürzeren, aber dickeren Segmenten der Flossenstrahlen als bei C. Frühere Studien haben ein ähnliches Wachstum während der Flossenregeneration durch Hemmung der Proteinphosphatase Calcineurin und auch durch einen integrierten Effekt der Calcineurin-Hemmung und bioelektrischen Signalisierung beschrieben wie Kaliumkanäle35,36. Daher können wir spekulieren, dass die P-Behandlung eine Rolle bei der Aktivierung der oben erwähnten Signalübertragung spielen könnte, was zu einer Verzögerung des herkömmlichen Zurückschaltens des Flossenwachstums auf ein isometrisches Muster führt.

Es wurde zuvor berichtet, dass das durch die Calcineurin-Hemmung bedingte Auswachsen der Flossen auch mit der Förderung der RA-Signalübertragung verbunden ist 35, 37 und daher wurde in dieser Studie eine mögliche Modulation der RA-Signalübertragung durch P in den regenerierten Flossen in Betracht gezogen. Darüber hinaus ist bekannt, dass die RA-Signalübertragung neben der Proliferation auch die Differenzierung und Mineralisierung von Osteoblasten beeinflusst. Dies legte uns nahe, die RA-Signalübertragung vor dem Hintergrund zu untersuchen, dass auch andere Osteoblasten-Differenzierungsmarkergene von der P-Behandlung betroffen waren (Abb. 3). Bei den ursprünglich amputierten Flossen (0 DPA), die 14 Tage lang mit Probiotika vorkonditioniert wurden, wurde interessanterweise eine Hochregulierung des RA-Rezeptors Rarga sowie Col10a1a beobachtet. Tatsächlich wurden die positiven Auswirkungen der P-Exposition auf den RA-Signalweg zuvor bei mit Probiotika behandelten Zebrafischen beschrieben, die eine verstärkte Verkalkung der Wirbel begünstigen4. Dies bestätigt die Aktivität von Probiotika bei der Regulierung von Genen, die neben der Modulation des Regenerationsprozesses auch eine Rolle bei der Knochenverkalkung spielen. Während der Regeneration nahm Rarga, das während der Blastembildung exprimiert wird, in Übereinstimmung mit der etablierten molekularen Regulierung des Regenerationsprozesses in C-Flossen zu, bei 5 DPA wurde jedoch eine Abnahme in P-Flossen festgestellt. In Anbetracht der Tatsache, dass der durch cyp26b1 vermittelte RA-Abbau eine wichtige Rolle bei der Förderung der Redifferenzierung der Präosteoblasten zu nicht-proliferativen Osteoblasten spielt, was eine wesentliche Voraussetzung für die Bildung neuer Knochen ist23, sind die höheren RA-Werte in C-Flossen im Vergleich zu P Flossen deuten auf eine Förderung der Proliferation der Präosteoblasten und eine geringere Redifferenzierung hin, wohingegen P-Flossen sich in einem vergleichsweise weiter fortgeschrittenen Regenerationsstadium befinden, das eine Redifferenzierung beinhaltet. Darüber hinaus deuten höhere Mengen an entpd5a in der vollständig regenerierten P-Flosse auf eine höhere Phosphatkonzentration hin, da entpd5a ein direkter Regulator der Phosphathomöostase ist39. Dennoch zeigen die FTIR-Ergebnisse zu beiden analysierten Zeitpunkten, dass P-Flossen in der distalen Zone eine höhere Menge an Phosphaten aufweisen als kristallisiertes HA. Da dieser Teil der Flosse gemäß der Physiologie der Knochenregeneration neu gebildet wird, lassen diese Ergebnisse vermuten, dass die P-Behandlung die Umwandlung von Phosphaten von der amorphen in eine besser organisierte Form beschleunigt und dadurch den Knochenreifungsprozess beschleunigt40.

Die deutlich höhere Expression von Markern für das frühe und mittlere Differenzierungsstadium der Osteoblasten wie runx2b, sp7, ctnnb1 und col10a1a in P-Flossen in der Mitte der Regeneration (5 DPA) bestätigt die Rolle von Probiotika bei der Modulation des Regenerationsprozesses in verschiedenen Stadien der Osteoblasten Entdifferenzierung und Proliferation. Runx2b ist ein Marker für das Präosteoblaststadium, der im Blastem während der Dedifferenzierung von Osteoblasten in den frühen Stadien der Regeneration zum Ausdruck kommt21 und sp7 wirkt hierarchisch stromabwärts von Runx2b im Differenzierungsweg. Runx2b reguliert auch die Expression anderer wichtiger Markergene verschiedener Stadien der Osteoblastendifferenzierung wie col10a1a, spp1, bglap und gilt daher als Schlüsselregulator. Col10a1a, das weiter stromabwärts von sp7 wirkt, markiert die Zwischenstadien der Skelettogenese (Stadien der Knochenmatrixablagerung)41. Es wird in frühen Osteoblasten und Chondrozyten während der intramembranösen und perichondralen Ossifikation von Fischgräten exprimiert42,43,44,45 und unsere Ergebnisse zeigten eine starke Herunterregulierung zum Endstadium der Regeneration (10 DPA). Die sequentielle Aktivierung früher Marker lässt die gleiche Schlussfolgerung zu, dass die P-Behandlung die frühen und mittleren Stadien der Osteoblasten-Differenzierungsprozesse nach einer Flossenamputation signifikant fördert. In Bezug auf die Mineralisierung wurden etablierte Markergene späterer Stadien der Osteoblastendifferenzierung und der Mineralisierung der extrazellulären Matrix wie bglap (Osteocalcin) und spp1 (Osteopontin), die beide stromabwärts wirken und durch sp7 und runx2 reguliert werden, ausgewertet21,22,46. In unserer Studie wurden beide während des Regenerationsprozesses hochreguliert, mit einer deutlich höheren Expression in den behandelten Flossen bei 5 DPA. Diese Ergebnisse werden durch die in P-Flossen gefundenen höheren kristallisierten HA-Werte weiter gestützt, was einen klaren Beweis für die Wirkung von P auch auf das Mineralisierungsstadium liefert.

Das Transkript von Ctnnb1 (β-Catenin) war in P-Flossen während der Regeneration signifikant höher, was auf eine Aktivierung der Wnt/β-Catenin-Signalübertragung durch P schließen lässt. Aus der Expression von zwei nachgeschalteten Zielgenen von β-Catenin, dem Zellproliferationsmarker ccnd1 und dem negativen Regulator von β -Catenin-Signalisierung Axin2 konnten wir beobachten, dass die erhöhte β-Catenin-Signalisierung bei 5 DPA in beiden Gruppen in Richtung 10 DPA unterdrückt wurde. Dies bestätigt, dass die gemessenen β-Catenin-Spiegel gut mit den verschiedenen Regenerationsstadien zusammenhängen und in der Proliferationsphase höher und in den späteren Phasen der Differenzierung/Reifung niedriger sind. Die erhöhte Expression von Sparc bei 5 DPA bestätigt weiter die früheren Berichte über die Beteiligung dieses Signalwegs an der Flossenregeneration, da Sparc für ein Matrixprotein kodiert, von dem bekannt ist, dass es die Osteoblastogenese steigert, indem es die β-Catenin-vermittelte Signalübertragung verstärkt und den Abbau von β-Catenin verhindert47 . Früher wurde festgestellt, dass Sparc bei 4 DPA-Regeneraten angereichert ist27, was weiter mit unserer Beobachtung einer deutlich höheren Sparc-Menge bei 5 DPA übereinstimmt, obwohl keine Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet wurden. Auch die höhere Expression von sost in der Mitte der Regeneration ist ein zusätzlicher Indikator für die Modulation der Wnt/β-Catenin-Signalisierung während der Blastembildung, da festgestellt wurde, dass Sklerostin während der frühen Flossenregeneration bei Zebrafischen im Blastem exprimiert wird16. In unserer Studie verursachte P die Herunterregulierung der sost-mRNA-Spiegel in P-Flossen und ein früherer Versuch mit Zebrafischlarven berichtete ebenfalls über eine Regulierung der sost-Spiegel durch probiotische Behandlung5. Die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung ist auch an der Unterdrückung der Osteoklastenaktivität beteiligt48,49 und dieser Beweis wird stark durch unsere Ergebnisse gestützt, die zeigen, dass P in der Lage ist, das Osteoklasten-Markergen ctsk27 während der Regeneration herunterzuregulieren.

Die Gesamtergebnisse legen nahe, dass die P-Behandlung den Regenerationsprozess der Schwanzflosse positiv beeinflusst. Auf molekularer Ebene beeinflusste P hauptsächlich die Regeneration in der Mitte (zusammengefasst in der ergänzenden Abbildung S3), und die wichtigsten modulierten Signalwege sind Wnt/β-Catenin und RA-Signalisierung. Die Behandlung führte zu einer Vergrößerung der regenerierten Fläche, beeinflusste die Morphologie der Flossen und erhöhte den Gehalt an gut kristallisiertem HA. Darüber hinaus kann FTIRI als geeignetes Instrument zur Untersuchung des Regenerationsprozesses vorgeschlagen werden. Da Probiotika ihre regulatorische Wirkung auf vielfältige Weise entfalten können, könnten als Folge dieser positiven Ergebnisse in Zukunft Studien durchgeführt werden, die die genaue Wirkungsweise von Probiotika auf die Regeneration auf zellulärer Ebene untersuchen. Da diese probiotische Mischung wichtige Vitamin-K2-Produzenten wie Bacillus subtilis enthält und Vitamin K2 eine entscheidende Klasse von Vitaminen ist, von denen bekannt ist, dass sie an der positiven Regulierung der Knochenentwicklung beteiligt sind50, können weitere Studien durchgeführt werden, die sich auf die probiotische Fähigkeit zur Produktion von Vitamin K2 konzentrieren. Kurz gesagt, der signifikante Einfluss der probiotischen Behandlung auf den Regenerationsprozess wurde am Modell der Schwanzflosse des Zebrafisches aufgedeckt. Diese Beobachtung könnte für Studien zur Knochenregenerationsmedizin nützlich sein, in denen Probiotika ein potenzieller prophylaktischer Kandidat zur Verbesserung der Knochengesundheit sein können.

Alle Verfahren mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem italienischen Tierversuchsgesetz durchgeführt und von der Ethikkommission der Università Politecnica delle Marche, Ancona, Italien, und vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Aut. Nr. 583/2020-PR). . Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren, und die Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Drei Monate alter Wildtyp-Zebrafisch (AB) mit einem Durchschnittsgewicht von 100 ± 7 mg und einer mittleren Gesamtlänge von 20 ± 2 mm, gehalten bei 28,0 °C, pH 7,0, Photoperiode 12:12 hell:dunkel, NO2 < 0,01 mg/L und NO3 < 10 mg/L wurden in der Fischanlage gesammelt und in eine Kontrollgruppe (C) (n = 24) und eine mit Probiotika behandelte Gruppe (P) (n = 24) aufgeteilt. Der Versuch wurde mit einer kommerziellen probiotischen Mischung, Bactosafe H (Bernaqua), durchgeführt, die aus einer Mischung von fünf verschiedenen Bakterien besteht – Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans und Lactobacillus acidophilus sowie der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Innerhalb der probiotischen Mischung, B. subtilis, ist der für uns interessante Stamm dafür bekannt, Vitamin K2 oder Menachinone zu produzieren, eine Gruppe proosteogener Vitamine10. Die C- und P-Gruppen erhielten zweimal täglich eine kommerzielle Diät (Zebrafeed, Sparos, Portugal) mit 3 % Körpergewicht und nur die P-Gruppe erhielt eine Nahrungsergänzung mit den Probiotika mit 106 KBE/ml. Der P-Gruppe wurde eine 14-tägige Vorkonditionierungsbehandlung mit Probiotika verabreicht, um die Darmbesiedlung zu verbessern. Am Ende der Vorkonditionierung wurden die Fische mit 0,1 g/l MS-222 (Sigma-Aldrich, USA) anästhesiert und die Schwanzflossen 1–2 Segmente vor der Gabelung der zweiten gegabelten Lepidotrichia amputiert29. Amputierte Flossen (0 DPA) wurden zur RNA-Extraktion bei -80 °C gelagert. Nach der Amputation wurde jeder Fisch separat gehalten, um biologische Replikate mit einer Dichte von 1 Fisch pro 200 ml in Glasbehältern zu erhalten, die mit Wasser aus dem Aufzuchtsystem gefüllt waren. Die Glasbehälter wurden in einem Wasserbad gehalten, das mit Heizgeräten und Luftsteinen ausgestattet war, um die Temperatur homogen zu halten. Den Fischen wurde erlaubt, sich bei 33,0 (± 1) °C zu regenerieren, um die Regeneration zu beschleunigen, wie bereits berichtet51. Während der Regeneration wurde den Fischen die gleiche Menge kommerzielles Futter und die gleiche P-Konzentration verabreicht wie in den 14 Tagen der Vorkonditionierung. Der individuelle Regenerationsprozess wurde verfolgt (n = 7 pro Gruppe), indem Bilder desselben Fisches vor der Amputation, nach der Amputation und bei 1, 5 und 10 DPA aufgenommen wurden. Regenerierte Schwanzflossenproben wurden bei 5 DPA gesammelt, was den mittleren Zeitpunkt der Regeneration darstellt, und bei 10 DPA als letztem Regenerationszeitpunkt für die RNA-Extraktion und FTIRI-Analyse. Flossen für die RNA-Extraktion (n = 9 pro Gruppe und Zeitpunkt) wurden bei -80 °C gelagert. Für die FTIRI-Analyse wurden die Flossen (n = 3 pro Gruppe und Zeitpunkt) 12 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, zweimal mit PBS gewaschen und dann in PBS bei + 4 °C gelagert.

Die Bilder wurden mit einem Stereomikroskop (Leica, Deutschland) vor der Amputation, nach der Amputation und bei 1, 5 und 10 DPA aufgenommen, um den Fortschritt der Regeneration in C- und P-Flossen zu verfolgen (n = 7 pro Gruppe). Die Fische wurden vor der Bildgebung mit MS-222 bei 0,6 mM betäubt und nach der Bildgebung konnten sich die Fische im Süßwasser mit Belüftung erholen. Morphologische Studien wurden durchgeführt, indem einige der zuvor beschriebenen Parameter gemessen wurden: REG (regenerierte Fläche), PED (Pedunkelbreite), STU (Stumpfbreite), RAY (Flossenstrahlbreite) und SEG (Segmentlänge) sowie zwei Verhältnisse REG/STU und REG/PED29. Flossenbilder wurden mit ImageJ (Version 2.1.0/1.53c; Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA) analysiert und die zur Analyse der Bilder verwendeten ImageJ-Makros wurden speziell für die Regenerationsparameter der Schwanzflosse geschrieben (bereitgestellt als ergänzende Daten S1). .

Die FTIRI-Analyse wurde mit einem Bruker INVENIO-Interferometer durchgeführt, das mit einem Hyperion 3000 IR-Vis-Mikroskop gekoppelt und mit einem FPA-Detektor (Bruker Optics, Ettlingen, Deutschland) ausgestattet war. Flossenproben von C- und P-Versuchsgruppen (n = 3 pro Gruppe und Zeitpunkt) wurden auf optischen CaF2-Fenstern abgeschieden. Mithilfe eines 15-fach-Kondensorobjektivs wurden bestimmte Bereiche auf jeder Rippenprobe ausgewählt. Die beiden nach der Amputation untersuchten Regionen im vierten gegabelten Flossenstrahl des Rückenflossenlappens werden beschrieben als: proximal – entsprechend der ersten distalen Gabelung und distal – entsprechend dem letzten Segmentgelenk vor der Actinotrichie (siehe Abb. 2a). Auf diesen Flächen wurden die IR-Karten im Transmissionsmodus im Spektralbereich 4000–800 cm−1 erfasst. Jede Karte hatte eine Seitengröße von 164 × 164 Mikrometern und war das Ergebnis von 4096 Pixeln/Spektren (256 Scans) mit einer räumlichen Auflösung von 2,56 × 2,56 Mikrometern. Roh-IR-Karten wurden hinsichtlich Kohlendioxid und Wasserdampf korrigiert und anschließend im gesamten Spektralbereich vektornormalisiert (Routinen zur atmosphärischen Kompensation und Vektornormalisierung, Softwarepaket OPUS 7.5). Durch Integration aller IR-Karten im Spektralbereich von 1185–980 cm−1 (zugeordnet zu den Streckschwingungen der Phosphatgruppen) wurden Falschfarbenbilder erhalten, die die topografische Verteilung der Phosphatgruppen darstellen. Es wurde eine willkürliche Farbskala verwendet, bei der die Farben Weiß/Hellrosa die Zonen mit der höchsten Phosphatabsorption darstellen, während Schwarz/Dunkelblau die Zonen mit der niedrigsten Phosphatabsorption kennzeichnen.

Auf jeder IR-Karte wurde eine Teilkarte (ca. 300 Spektren/Pixel) entsprechend dem Knochen in den beiden analysierten Regionen extrahiert. Das durchschnittliche Spektrum und die durchschnittlichen ± Standardabweichungsspektren wurden berechnet und die Kurve wurde im Spektralbereich von 1800–900 cm−1 angepasst. Die Anzahl und die Position (ausgedrückt in Wellenzahlen, cm−1) der zugrunde liegenden Bänder wurden durch Minimaanalyse der zweiten Ableitung identifiziert und während des Verfahrens mit Gaußschen Funktionen (GRAMS/AI 9.1, Galactic Industries, Inc., Salem, New Hampshire) fixiert. Die integrierten Flächen (A) der zugrunde liegenden Banden wurden zur Berechnung der folgenden Bandenflächenverhältnisse verwendet: A1655/A1024 (Protein-zu-Phosphat-Verhältnis), A1240/A1024 (Kollagen-zu-Phosphat-Verhältnis) und A1024/A1090 (gut kristallisiertes HA zu schlecht). kristallisiertes HA-Verhältnis).

Es wurden Pools mit jeweils drei Flossen erstellt, um zu jedem Zeitpunkt drei Wiederholungen pro Gruppe zu erhalten. Die Gesamt-RNA wurde mit RNAeasy Microkit (Qiagen, Italien) aus amputierten Schwanzflossen (0 DPA) und regenerierten Schwanzflossen (5 und 10 DPA) extrahiert. Anschließend wurde es in 20 µl nukleasefreiem Wasser molekularer Qualität eluiert. Die endgültigen RNA-Konzentrationen wurden mit einem Nanophotometer bestimmt. Die Gesamt-RNA wurde mit DNase (10 IE bei 37 °C für 10 Minuten, MBI Fermentas) behandelt. Ein Mikrogramm Gesamt-RNA wurde für die cDNA-Synthese mit dem iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Italien) verwendet und bis zur weiteren Verwendung wie zuvor beschrieben bei -20 °C gelagert52.

qRT-PCRs wurden in C- und P-Flossen (n = 3 für C und P zu jedem Zeitpunkt) mit SYBR-Grün (Bio-Rad, Mailand, Italien) in einem CFX-Thermocycler (Bio-Rad, Mailand, Italien) durchgeführt ) wie zuvor beschrieben53. Das thermische Profil für alle Reaktionen betrug 3 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 45 Zyklen von 20 Sekunden bei 95 °C, 20 Sekunden bei 60 °C und 20 Sekunden bei 72 °C. Die Analyse der Dissoziationskurve zeigte in allen Fällen einen einzigen Peak. Ribosomales Protein L13 (rpl13) und ribosomales Protein, groß, P0 (rplp0) wurden als Haushaltsgene verwendet, um die Ergebnisse zu standardisieren, indem Variationen in der mRNA- und cDNA-Menge eliminiert wurden. In den Negativkontrollen wurde kein Amplifikationsprodukt beobachtet und es wurde nie eine Primer-Dimer-Bildung beobachtet. Die Daten wurden mit dem iQ5 Optical System Version 2.1 (Bio-Rad) analysiert, einschließlich Genex Macro iQ5 Conversion und Genex Macro iQ5-Dateien. Die Veränderung der Genexpression zwischen den Versuchsgruppen wird als relative mRNA-Häufigkeit (willkürliche Einheiten) angegeben. Primer wurden in einer Endkonzentration von 10 pmol/ml verwendet. Alle in der Studie verwendeten Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt.

Der T-Test wurde verwendet, um die Unterschiede der morphologischen Regenerationsparameter zwischen den Gruppen zu analysieren. Eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Post-hoc-Tests wurde sowohl auf IR- als auch auf qRT-PCR-Daten angewendet, um Unterschiede zwischen Versuchsgruppen zu vergleichen. Alle Tests wurden mit R Version 3.6.154 durchgeführt und Diagramme wurden mit ggplot2 3.2.1 erstellt. Die statistische Signifikanz wurde für alle Tests auf p < 0,05 festgelegt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Diese Arbeit ist Teil eines Projekts, das vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Zuschussvereinbarung Nr. 766347 an OC gefördert wurde. Die Autoren danken Dr. Manu Kumar Gundappa für die R-Skripte und die Makros, die im ImageJ verwendet werden.

Abteilung für Lebens- und Umweltwissenschaften, Polytechnische Universität Marken, Via Brecce Bianche, 60131, Ancona, Italien

Jerry Maria Sojan, Giorgia Gioacchini, Elisabetta Giorgini, Patrick Orlando, Luca Tiano, Francesca Maradonna und Oliana Carnevali

Nationales Institut für Biostrukturen und Biosysteme – Interuniversitäres Konsortium, Viale delle Medaglie d'Oro 305, 00136, Rom, Italien

Francesca Maradonna & Oliana Carnevali

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OC, JMS und FM konzipierten das Experiment, JMS, PO und GG führten formale Analysen durch, GG, FM und EG validierten Daten, JMS, OC, FM, GG und LT verfassten den Hauptmanuskripttext. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Francesca Maradonna oder Oliana Carnevali.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sojan, JM, Gioacchini, G., Giorgini, E. et al. Schwanzflosse des Zebrafisches als Modell zur Untersuchung der Rolle von Probiotika bei der Knochenregeneration. Sci Rep 12, 8057 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12138-z

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Eingegangen: 06. September 2021

Angenommen: 25. April 2022

Veröffentlicht: 16. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12138-z

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